菌种保存有哪些常用方法及最佳温度？
菌种保存
菌种保存对于科研、生产等诸多领域都极为重要，正确的保存方法能确保菌种的活性、纯度和特性长时间稳定。下面为你详细介绍菌种保存的常见方法及具体操作步骤，就算你是小白也能轻松上手。
斜面低温保存法
这是一种简单且常用的短期保存方法。首先，要准备好合适的斜面培养基，不同菌种适用的培养基不同，比如细菌常用普通琼脂斜面，真菌则常用马铃薯葡萄糖琼脂斜面。将培养基融化后，倒入无菌的试管中，每管约装 1/4 - 1/3 高度，然后倾斜放置，待其冷却凝固后就形成了斜面。
接着，进行菌种的接种。在无菌操作台上，用接种环从原始菌种中挑取少量菌体，划线接种到斜面培养基上。对于细菌，一般采用分区划线法；对于真菌，可以采用点植法或划线法。接种完成后，将试管放在适宜的温度下培养，让菌种生长繁殖，直到长出良好的菌落。
最后，将培养好的斜面放入 4℃的冰箱中保存。这种方法一般能保存细菌 1 - 3 个月，真菌 3 - 6 个月。不过，每隔一段时间需要重新转接一次菌种，以保证菌种的活性。
液体石蜡保存法
液体石蜡保存法是在斜面低温保存法的基础上进行的，可以延长菌种的保存时间。先按照斜面低温保存法准备好斜面培养基并接种培养好菌种。
然后，将经过高温灭菌并冷却至室温的液体石蜡，在无菌操作条件下，缓慢地覆盖在长好菌种的斜面上，覆盖的厚度以没过斜面顶端 1 - 2 厘米为宜。这样做的目的是隔绝空气，减缓菌种的代谢活动。
之后，将覆盖了液体石蜡的斜面试管垂直放置在室温或 4℃的冰箱中保存。这种方法保存细菌一般能保存 1 - 2 年，真菌能保存 2 - 3 年。使用时，只需用接种环挑取少量菌体即可，不需要去除液体石蜡。
甘油冷冻保存法
甘油冷冻保存法适用于大多数微生物的长期保存。首先，要配制甘油溶液，一般使用体积分数为 20% - 50%的甘油水溶液，将甘油和无菌水按比例混合，然后进行高压蒸汽灭菌。
接着，取适量的菌种悬液（可以是液体培养的菌液，也可以是从斜面上刮下的菌体用无菌水制成的悬液），与等体积的灭菌甘油溶液混合均匀，使甘油的最终体积分数达到 10% - 25%。
然后，将混合好的菌液-甘油混合物分装到无菌的冷冻管中，每管约 0.5 - 1 毫升。分装完成后，迅速将冷冻管放入 -20℃或 -80℃的超低温冰箱中保存。这种方法保存的菌种，在 -20℃下一般能保存 1 - 2 年，在 -80℃下能保存数年甚至更长时间。使用时，从冰箱中取出冷冻管，在 37℃水浴中快速解冻，然后进行适当的稀释和接种操作。
砂土管保存法
砂土管保存法常用于保存能产生孢子的微生物，如放线菌和霉菌。先准备干净的砂和土，将砂和土分别过筛，去除杂质和大颗粒，然后按一定比例（如砂:土 = 3:2）混合均匀。
接着，将混合好的砂土装入干净的试管中，装至试管高度的 1/2 - 2/3，然后用高压蒸汽灭菌锅进行灭菌，一般需要灭菌 2 - 3 次，每次间隔 1 - 2 天，以确保彻底杀灭砂土中的微生物。
在无菌操作条件下，将孢子悬液滴加到砂土管中，用无菌的玻璃棒搅拌均匀，使孢子均匀地吸附在砂土颗粒上。滴加的孢子悬液量以砂土表面湿润但不积水为宜。
最后，将砂土管放在干燥器中干燥数天，待砂土完全干燥后，用火焰封口或用橡皮塞密封，然后放在 4℃的冰箱中保存。这种方法保存的菌种，一般能保存数年。使用时，用无菌水将砂土管中的孢子洗下，然后进行接种培养。
不同的菌种保存方法各有优缺点，在实际应用中，可以根据菌种的类型、保存时间的要求以及实验条件等因素来选择合适的保存方法。同时，在保存菌种的过程中，一定要注意无菌操作，防止杂菌污染，以确保菌种的质量和活性。
菌种保存的常用方法有哪些？
菌种保存对于科研、工业生产以及生物技术领域来说都非常重要，正确的保存方法可以确保菌种的活性和遗传稳定性。以下是几种常用的菌种保存方法，每种方法都有其适用场景和操作要点，下面将详细介绍。
斜面低温保存法
这是最基础、最常用的菌种短期保存方法。具体操作是将菌种接种到适合其生长的固体斜面培养基上，在适宜温度下培养至对数生长期或稳定期，然后放入4℃冰箱保存。斜面保存适合大多数细菌、真菌和放线菌，保存期一般为3-6个月。操作时需要注意培养基的配方要适合目标菌种，斜面长度要适中，接种量不宜过大，避免菌落重叠影响保存效果。保存期间要定期检查菌落生长情况，如发现污染或菌落老化要及时转种。
液体石蜡覆盖保存法
这种方法是在斜面低温保存法的基础上改进而来，适合需要长期保存的菌种。操作时先制备斜面培养基，接种目标菌种培养至对数生长期，然后在斜面上覆盖一层无菌的液体石蜡（厚度约0.5-1cm），最后放入4℃冰箱保存。液体石蜡可以隔绝空气，减缓培养基水分蒸发，抑制菌种代谢活动，从而延长保存期。这种方法保存期可达1-2年，甚至更久。操作时要注意液体石蜡必须是无菌的，覆盖前要确保斜面菌落干燥，避免石蜡中混入水分导致污染。
甘油冷冻保存法
这是目前最常用的菌种长期保存方法之一，适合大多数微生物。操作时将菌种培养至对数生长期，用无菌生理盐水或培养基制成菌悬液，然后与等体积的灭菌甘油（终浓度20-50%）混合，分装到无菌冻存管中，放入-20℃或-80℃超低温冰箱保存。甘油可以降低冰点，防止细胞内水分结冰导致细胞破裂，从而保护菌种活性。这种方法保存期可达数年甚至更久。操作时要注意甘油必须是无菌的，分装时要避免反复冻融，最好一次性分装足够量。
真空冷冻干燥保存法
这是目前最可靠的菌种长期保存方法，适合珍贵菌种或需要长期保存的菌种。操作时先将菌种培养至对数生长期，用无菌保护剂（如脱脂牛奶、血清等）制成菌悬液，然后分装到安瓿瓶或冻干管中，放入冷冻干燥机中进行预冻和干燥处理，最后真空封口保存。这种方法可以完全去除水分，抑制所有微生物活动，保存期可达数十年。操作时要注意保护剂的选择要适合目标菌种，预冻和干燥过程要严格控制温度和时间，避免菌种死亡。
滤纸片保存法
这种方法适合孢子类微生物（如霉菌、放线菌）的保存。操作时将菌种培养至产生大量孢子，用无菌生理盐水洗下孢子制成孢子悬液，然后将无菌滤纸片浸入孢子悬液中，取出晾干后装入无菌信封或试管中，放入4℃冰箱保存。这种方法保存期一般为1-2年。操作时要注意滤纸片要完全干燥，避免发霉，保存期间要定期检查孢子活性。
液氮超低温保存法
这是目前保存活性要求最高的菌种的方法，适合所有微生物。操作时将菌种与保护剂混合后，分装到冻存管中，先放入-80℃冰箱预冷，然后迅速投入液氮（-196℃）中保存。液氮可以完全抑制所有生物活动，保存期理论上可以无限延长。操作时要注意液氮罐的管理要规范，避免冻伤，冻存管要使用专用耐低温材质。
每种保存方法都有其优缺点，选择时要根据菌种类型、保存期限、实验室条件等因素综合考虑。对于普通实验室，斜面低温保存法和甘油冷冻保存法是最常用的；对于需要长期保存或珍贵菌种，建议采用真空冷冻干燥保存法或液氮超低温保存法。无论采用哪种方法，都要严格遵守无菌操作原则，定期检查菌种活性，确保保存效果。
菌种保存的最佳温度是多少？
菌种保存的最佳温度取决于菌种的类型和保存的目的，不同菌种对温度的敏感性和适应性各不相同。一般来说，菌种保存的常用温度范围主要分为低温保存和超低温保存两种。
对于大多数细菌和真菌菌种，4℃的低温保存是常用的方法之一。这种温度下，菌种的代谢活动会显著减缓，但不会完全停止，因此可以保持菌种的活性一段时间。4℃保存适用于短期保存，比如几周到几个月，尤其适用于那些对冷冻敏感的菌种。不过，需要注意的是，4℃保存的菌种需要定期检查其活性，因为长时间保存可能会导致菌种活力下降或发生变异。
如果需要长期保存菌种，通常会选择超低温保存，即-80℃或更低的温度。在这种温度下，菌种的代谢活动几乎完全停止，可以长期保持菌种的遗传稳定性和活性。超低温保存通常使用甘油或二甲基亚砜（DMSO）等保护剂，将菌种悬浮在保护剂中后，分装到小管中，再放入超低温冰箱或液氮罐中保存。这种方法适用于几年甚至更长时间的保存，但需要确保保存设备的稳定性和可靠性，避免温度波动对菌种造成损害。
除了上述两种常用温度外，还有一些特殊菌种可能需要特定的保存温度。例如，某些嗜热菌需要在较高的温度下保存，以维持其活性；而某些嗜冷菌则需要在接近冰点的温度下保存。因此，在选择菌种保存温度时，一定要参考菌种的特性和相关文献资料，确保选择最适合的保存条件。
总之，菌种保存的最佳温度并非一成不变，而是需要根据菌种的类型、保存的目的以及实验室的条件来综合考虑。选择合适的保存温度和方法，可以确保菌种的遗传稳定性和活性，为后续的实验和研究提供可靠的菌种资源。
菌种保存需要哪些特殊设备？
菌种保存是微生物研究和应用中的关键环节，正确选择和操作特殊设备能确保菌种的活性、纯度及长期稳定性。以下从设备类型、功能特点、操作要点三个层面详细介绍所需设备及使用方法，帮助零基础用户快速掌握。
一、低温存储设备：核心保障
菌种保存的首要条件是低温环境，不同保存周期需匹配不同设备。
1. 普通冰箱（4℃）
适用于短期保存（数天至数周），如常用工作菌种的临时存放。需选择独立温控、无霜设计的医用冰箱，避免频繁开关门导致温度波动。存放时需用密封盒或试管架固定，防止倾倒污染。
2. 超低温冰箱（-20℃至-80℃）
中期保存（数月至1年）的常用设备，-80℃冰箱可显著降低菌种代谢活动。需配备温度记录仪，定期检查设备运行状态。存放时建议使用冻存管，并标注菌种名称、保存日期及操作者信息，避免混淆。
3. 液氮罐（-196℃）
长期保存（数年）的首选设备，通过超低温冻结实现菌种“休眠”。需选择防爆型液氮罐，配备液位报警装置，定期补充液氮（建议每周检查液位）。操作时需佩戴防冻手套，使用长柄镊子取放冻存管，避免直接接触液氮。
二、干燥设备：脱水保存关键
对于需脱水保存的菌种（如孢子类），干燥设备是核心。
1. 真空冷冻干燥机
通过低温真空环境去除菌种水分，形成干燥粉末，可长期保存（5年以上）。操作需分三步：前处理（将菌种悬浮于保护剂中）、预冻（-40℃以下）、干燥（真空度≤10Pa，时间12-24小时）。设备需配备压力表和温度传感器，确保过程可控。
2. 硅胶干燥器
简易干燥方法，适用于少量菌种保存。将菌种涂布于滤纸片，与变色硅胶（蓝色变粉红色需更换）共置于干燥器内，密封后存放于阴凉处。需定期检查硅胶颜色，避免湿度回升导致菌种失活。
三、厌氧保存设备：特殊菌种需求
对于厌氧菌（如双歧杆菌），需创造无氧环境。
1. 厌氧培养箱
集成温度、湿度、气体控制功能，可长期维持厌氧状态（O₂浓度＜0.5%）。操作前需用氮气置换箱内空气，通过催化剂去除残留氧气。存放时需使用密封厌氧袋或培养管，避免与空气接触。
2. 厌氧罐
便携式设备，适用于短期保存。将菌种置于罐内，加入厌氧产气包（含焦亚硫酸钠等），密封后摇匀，10分钟内可形成厌氧环境。需定期更换产气包，确保效果稳定。
四、辅助设备：细节决定成败
1. 生物安全柜
操作高致病性菌种时，需在Ⅱ级生物安全柜内进行，防止交叉污染。使用前需紫外灯消毒30分钟，操作时保持气流稳定（0.3-0.5m/s）。
2. 离心机
菌种浓缩时需使用低温离心机（4℃），防止高温破坏细胞结构。选择角转头或水平转头，根据菌种类型调整转速（3000-5000rpm）和时间（5-10分钟）。
3. pH计与电子天平
配制保护剂（如甘油、脱脂牛奶）时需精确测量pH值（建议5.5-7.0）和称量试剂，确保配方准确性。
五、操作规范与维护要点
1. 设备校准：每月用标准温度计校准冰箱/液氮罐，偏差＞1℃需调整；每年请专业机构检测真空泵性能。
2. 清洁消毒：超低温冰箱内壁每月用75%酒精擦拭；液氮罐颈部每月除霜，避免冰堵。
3. 应急预案：超低温冰箱故障时，立即将菌种转移至备用冰箱或液氮罐；液氮罐泄漏时，迅速撤离并联系供应商处理。
通过合理配置上述设备并严格遵循操作规范，可实现菌种的高效、安全保存。对于初学者，建议从普通冰箱+硅胶干燥器开始，逐步积累经验后再升级设备。定期记录设备运行数据和菌种状态，能为后续研究提供重要参考。
